豬偽狂犬病毒實時熒光PCR試劑盒使用說明
【試劑盒簡介】
豬偽狂犬病毒實時熒光PCR試劑盒▩•◕╃•，採用聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測豬血清和組織中的PRV▩•◕╃•，適用於PRV的檢測◕✘↟、診斷和流行病學調查✘·│。
【原理】
提取DNA作為模板▩•◕╃•，在DNA聚合酶的作用下▩•◕╃•，經高溫變性◕✘↟、低溫退火和中溫延伸的多次迴圈▩•◕╃•，使特異DNA片段的複製數放大數百萬倍✘·│。將擴增的DNA片段進行電泳◕✘↟、染色後▩•◕╃•，在紫外燈下▩•◕╃•，肉眼可見DNA片段的擴增帶✘·│。
【試劑盒組份】
| 1. 裂解液 | 8mL | 8. 陽性對照 | |
| 2. 蛋白酶K | 110μL | 9. 0.2 mL 薄壁PCR 管 | 15個 |
| 3. 抽提液 | 8mL | 10. PCR 反應液A | 180μL |
| 4. 異丙醇 | 7mL | 11. PCR 反應液B | 50μL |
| 5. 洗滌液 | 12mL | 12. 50 倍TAE 電泳緩衝液 | 20mL |
| 6. 無菌水 | 500μL | 13. 染色液 | |
| 7. 陰性對照 | 300μL | | 10μL
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注•₪▩：塑膠袋內試劑(陽性對照◕✘↟、蛋白酶K◕✘↟、PCR反應液A和B)-20 ℃凍存▩•◕╃•，其他室溫儲存✘·│。
黃麴黴毒素M1檢測試劑盒(酶免)
三聚氰胺檢測試劑盒(酶免)
磺胺二甲基嘧啶檢測試劑盒(酶免)
孔雀石綠定量檢測試劑盒(酶免)
金黴素定量檢測試劑盒(酶免)
【豬偽狂犬病毒實時熒光PCR試劑盒操作方法】
一◕✘↟、病毒DNA的提取
1.取出已處理的樣品◕✘↟、陰性對照和陽性對照▩•◕╃•，分別加入600µL抽提液(用抽提液之前不要晃動▩•◕╃•，不要吸到上層保護液)▩•◕╃•，用力顛倒10次混勻▩•◕╃•，12,000rpm離心10min✘·│。
2.取500µL上清置於滅菌離心管中▩•◕╃•，加入500µL異丙醇▩•◕╃•，混勻▩•◕╃•，置液氮中3min或-70℃冰箱中30min✘·│。取出樣品管▩•◕╃•，室溫融化▩•◕╃•，13,000rpm離心15min✘·│。
3.棄上清▩•◕╃•，沿管壁緩緩加入1mL洗滌液▩•◕╃•，輕輕旋轉一週後倒掉▩•◕╃•，將離心管倒扣於吸水紙上1min▩•◕╃•，再將離心管真空抽乾15min或37℃烘乾✘·│。
4.用30µL無菌水溶解沉澱▩•◕╃•，作為模板備用✘·│。
二◕✘↟、樣品製備
1.樣品採集•₪▩：病死或撲殺的豬▩•◕╃•，取大腦海馬背側皮層◕✘↟、中腦◕✘↟、腦橋◕✘↟、扁桃體◕✘↟、淋巴結等組織；待檢活豬▩•◕╃•，用棉拭子取鼻腔分泌物▩•◕╃•，置於50%甘油生理鹽水中▩•◕╃•，或用注射器取血5mL▩•◕╃•，2～8℃儲存✘·│。(要求送檢病料新鮮▩•◕╃•，嚴禁反覆凍融✘·│。)
2.樣品處理•₪▩：
2.1組織樣品的處理•₪▩：稱取組織0.1g於研磨器中磨碎▩•◕╃•，再加1mL生理鹽水繼續磨至無塊狀物；然後將樣品轉至1.5mL滅菌離心管中▩•◕╃•，8000rpm離心5min▩•◕╃•，取上清100µL於1.5mL滅菌離心管中▩•◕╃•，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K▩•◕╃•，混勻後37℃溫育1h✘·│。
2.2全血樣品的處理•₪▩：待血凝後取血清放於離心管中▩•◕╃•，8000rpm離心5min▩•◕╃•，取上清100µL於1.5mL滅菌離心管中▩•◕╃•，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K▩•◕╃•，混勻後37℃溫育1h✘·│。
2.3陽性對照的處理•₪▩：混勻後取100µL於1.5mL滅菌離心管中▩•◕╃•，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K▩•◕╃•，混勻後37℃溫育1h✘·│。
2.4陰性對照的處理•₪▩：混勻後取100µL於1.5mL滅菌離心管中▩•◕╃•，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K▩•◕╃•，混勻後37℃溫育1h✘·│。
三◕✘↟、PCR
1.反應體系•₪▩：分別取16µLPCR反應液A(用前混勻)◕✘↟、2µLPCR反應液B(用前混勻)和2µL模板DNA▩•◕╃•，混勻✘·│。
2.反應程式•₪▩：在PCR儀上執行以下程式•₪▩：94℃3min；94℃30s◕✘↟、55℃30s◕✘↟、72℃30s▩•◕╃•，35個迴圈；72℃延伸10min✘·│。
四◕✘↟、電泳
1.制膠•₪▩：用50倍稀釋的TAE電泳緩衝液配製1%瓊脂糖凝膠✘·│。
2.電泳•₪▩：待膠凝固後▩•◕╃•，取5µLPCR擴增產物點樣於瓊脂糖凝膠孔中▩•◕╃•，以5V/cm的電壓於50倍稀釋的TAE電泳緩衝液中電泳✘·│。
3.染色•₪▩：取50倍稀釋的TAE電泳緩衝液30mL▩•◕╃•，加入10µL染色液▩•◕╃•，混勻後將膠浸泡30min▩•◕╃•，於紫外燈下觀察結果✘·│。
【結果判斷】
陽性對照出現400bp擴增帶▩•◕╃•，陰性對照無帶出現(引物帶除外)時▩•◕╃•，實驗結果成立✘·│。被檢樣品出現400bp擴增帶為豬偽狂犬病毒陽性▩•◕╃•，否則為陰性✘·│。
【需用但未提供的材料】
組織研磨器◕✘↟、眼科剪◕✘↟、眼科鑷◕✘↟、一次性注射器◕✘↟、瓊脂糖◕✘↟、滅菌1.5mL離心管和吸頭(10µL◕✘↟、200µL◕✘↟、1000µL)✘·│。
【豬偽狂犬病毒實時熒光PCR試劑盒注意事項】
1.本試劑盒有效期為6個月▩•◕╃•，不要使用超過有效期限的試劑▩•◕╃•，試劑盒之間的組分不要混用✘·│。
2.所有試劑應在規定的溫度儲存▩•◕╃•，使用時拿到室溫下▩•◕╃•，使用後立即放回✘·│。
