豬圓環病毒熒光PCR試劑盒使用說明書
【試劑盒簡介】
豬圓環病毒熒光PCR試劑盒│☁，採用聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測豬血清和組織中的PCV│☁，適用於PCV的檢測↟↟✘✘、診斷和流行病學調查₪✘₪。
【原理】
提取DNA作為模板│☁，在DNA聚合酶的作用下│☁，經高溫變性↟↟✘✘、低溫退火和中溫延伸的多次迴圈│☁，使特異DNA片段的複製數放大數百萬倍₪✘₪。將擴增的DNA片段進行電泳↟↟✘✘、染色後│☁，在紫外燈下│☁，肉眼可見DNA片段的擴增帶₪✘₪。
【試劑盒組份】
| 1. 生理鹽水 | 20mL | 8. 吸附柱和收集管 | 10套 |
| 2. 裂解液 | 6mL | 9. 0.2 mL 薄壁PCR 管 | 15個 |
| 3. 洗滌液A | 7mL | 10. RT-PCR 反應液A | 180μL |
| 4. 洗滌液B | 7mL | 11. RT-PCR 反應液B | 50μL |
| 5. 洗脫液 | 500μL | 12. 50 倍TAE 電泳緩衝液 | 20mL |
| 6. 陰性對照 | 300μL | 13. 染色液 | 10μL |
| 7. 陽性對照 | 300μL | |
|
注↟↟₪·：塑膠袋內試劑(陽性對照↟↟✘✘、RT-PCR反應液A和B)-20 ℃凍存│☁，裂解液2-8℃冷藏│☁，其他室溫儲存₪✘₪。
【操作方法】
一↟↟✘✘、樣品製備
1樣品採集↟↟₪·：病死或撲殺的豬│☁，取肺↟↟✘✘、扁桃體和腦等組織；待檢活豬│☁，用注射器取血5mL│☁，2～8℃儲存₪✘₪。(要求送檢病料新鮮│☁，嚴禁反覆凍融₪✘₪。)
2樣品處理↟↟₪·：
2.1組織樣品的處理↟↟₪·：稱取組織0.1g於研磨器中磨碎│☁，再加1mL生理鹽水繼續磨至無塊狀物；然後將樣品轉至1.5mL滅菌離心管中│☁，8000rpm離心2min│☁，取100µL上清於1.5mL滅菌離心管中₪✘₪。
2.2全血樣品的處理↟↟₪·：待血凝後取100µL血清於1.5mL滅菌離心管中₪✘₪。
2.3陽性對照的處理↟↟₪·：取陽性對照100µL於1.5mL滅菌離心管中₪✘₪。
2.4陰性對照的處理↟↟₪·：取陰性對照100µL於1.5mL滅菌離心管中₪✘₪。
二↟↟✘✘、病毒RNA的提取
1.取已處理的樣品↟↟✘✘、陰性對照和陽性對照│☁，分別加入450µL裂解液│☁，充分顛倒混勻│☁，室溫靜置3min₪✘₪。
2.加入275µL無水乙醇│☁，輕輕混勻₪✘₪。
3.將混合液吸入吸附柱中(吸取液體時儘量不要吸到懸浮雜質│☁，以免離心時堵塞吸附柱)│☁，10,000rpm離心1min│☁，棄去收集管中液體│☁，套回收集管₪✘₪。
4.向吸附柱中加入500µL洗滌液A│☁，10,000rpm離心1min│☁，棄去收集管中液體│☁，套回收集管₪✘₪。
5.向吸附柱中加入500µL洗滌液B│☁，10,000rpm離心1min│☁，棄去收集管中液體│☁，套回收集管₪✘₪。
6.空柱10,000rpm離心2min₪✘₪。
7.將吸附柱移入新的無RNA酶的1.5mL離心管中│☁，在膜中央加入30µL洗脫液│☁，室溫靜置2min│☁，10,000rpm離心1min│☁，獲得總RNA₪✘₪。
三↟↟✘✘、RT-PCR
1.反應體系↟↟₪·：分別取14µLRT-PCR反應液A(用前混勻)↟↟✘✘、4µLRT-PCR反應液B(用前混勻)和2µL模板RNA│☁，混勻₪✘₪。
2.反應程式↟↟₪·：在PCR儀上執行以下程式↟↟₪·：42℃45min│☁，94℃3min；94℃30s↟↟✘✘、53℃30s↟↟✘✘、72℃30s│☁，35個迴圈；72℃延伸10min₪✘₪。
四↟↟✘✘、電泳
1.制膠↟↟₪·：用50倍稀釋的TAE電泳緩衝液配製1%瓊脂糖凝膠₪✘₪。
2.電泳↟↟₪·：待膠凝固後│☁，取5µLPCR擴增產物點樣於瓊脂糖凝膠孔中│☁，以5V/cm的電壓於50倍稀釋的TAE電泳緩衝液中電泳₪✘₪。
3.染色↟↟₪·：取50倍稀釋的TAE電泳緩衝液30mL│☁，加入10µL染色液│☁，混勻後將膠浸泡30min│☁，於紫外燈下觀察結果₪✘₪。
【結果判斷】
陽性對照出現494bp擴增帶│☁，陰性對照無帶出現(引物帶除外)時│☁，實驗結果成立₪✘₪。被檢樣品出現494bp擴增帶為豬藍耳病毒陽性│☁，否則為陰性₪✘₪。
【需用但未提供的材料】
組織研磨器↟↟✘✘、眼科剪↟↟✘✘、眼科鑷↟↟✘✘、一次性注射器↟↟✘✘、瓊脂糖↟↟✘✘、經焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌1.5mL離心管和吸頭(10µL↟↟✘✘、200µL↟↟✘✘、1000µL)₪✘₪。
【豬圓環病毒熒光PCR試劑盒注意事項】
1.本試劑盒有效期為6個月│☁，不要使用超過有效期限的試劑│☁，試劑盒之間的組分不要混用₪✘₪。
2.所有試劑應在規定的溫度儲存│☁，使用時拿到室溫下│☁，使用後立即放回₪✘₪。
3.注意防止試劑盒組分受汙染₪✘₪。使用前將塑膠袋內試劑瞬離15s│☁，使液體全部沉於管底│☁，放於冰盒中│☁，吸取液體時移液器吸頭儘量在液體表面層吸取₪✘₪。
4.嚴格按試劑盒說明書操作可以獲得的結果₪✘₪。操作過程中移液↟↟✘✘、定時等全部過程必須精確₪✘₪。
5.RNA提取過程中│☁，應戴口罩↟↟✘✘、勤換手套│☁，儘量縮短操作時間₪✘₪。
6.所有接觸病料的物品均應合理處理│☁，以免汙染實驗室₪✘₪。
