五種致瀉性大腸埃希氏菌鑑定試劑盒PCR法

五種致瀉性大腸埃希氏菌鑑定試劑盒PCR法

u  產品說明

五種致瀉性大腸埃希氏菌鑑定試劑盒PCR法可針對食品·✘▩◕╃、飼料等樣品中的致病微生物的特異核酸片段進行擴增│•☁，儀器實時監測擴增過程中的熒光訊號變化│•☁，自動判讀結果☁✘₪。本產品用於致瀉大腸埃希氏菌的檢測☁✘₪。檢出限為 103 CFU/ml☁✘₪。

◆    產品組成（96 測試）

◆   所需儀器

ABI │•☁，BioRad│•☁，TaKaRa 等 PCR 擴增儀│•☁，電泳儀│•☁，凝膠成像儀等電泳配套裝置☁✘₪。（使用熒光定量 PCR 儀進行定性判讀時則無需電泳裝置）

◆   自備耗材和儀器

①滅菌 1.5mL 或 2.0mL 離心管；②冰盒；③移液器（0.5-10μL│•☁，10-100μL│•☁，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；④ 離心機；⑤渦旋混勻器；⑥金屬浴☁✘₪。

◆   樣品處理

參照《GB4789.6—2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗》中的操作步驟進行前增菌☁✘₪。建議使用試劑配套細菌基因組 DNA 提取系列產品☁✘₪。

◆   實驗操作

1.試劑配製（試劑配製區│•☁，放置於冰盒中進行）取出各管試劑│•☁，將試劑*解凍│•☁，離心 30s☁✘₪。取 12×(所待檢樣品數+3)的 PCR 反應管│•☁，按 12 個一組排列並編號│•☁，依次向各管中加入 23μL 的 12 種反應液☁✘₪。

2.新增模板（樣本製備區│•☁，放置於冰盒中進行）向每管反應液中分別加入 2μL 模板（或直接使用無菌吸頭挑取少許待檢菌落至反應管中）☁✘₪。加樣示例••╃││：（有 N 個待測樣品）

取(N+3)組 12 個一組的反應管│•☁，按順序第一組 12 管中全部加入 2μL 的 NG-DW│•☁，第二組 12管中全部加入 2μL的 NG-Ecoli│•☁，第三組 12 管中全部加入 2μL 的樣品 1 模板│•☁，第四組 12 管中全部加入 2μL 的樣品 2 模板│•☁，…│•☁，最後組 12 管中全部加入 2μL 的PG-Ecoli☁✘₪。

蓋好 PCR 管蓋後│•☁，渦旋混勻 30s│•☁，離心 1min│•☁，立即進行 PCR 擴增反應☁✘₪。

3.擴增反應（擴增及產物分析區）

按下列條件設定擴增反應••╃││：（如需使用熒光法進行檢測請選擇 FAM 通道）

4.產物電泳（擴增及產物分析區）

稱量 4. 0g 瓊脂糖粉│•☁，加入至 200 mL 的 1×TAE 電泳緩衝液中│•☁，充分混勻☁✘₪。使用微波爐反覆加熱至沸騰│•☁，直到瓊脂糖粉*融化形成清亮透明的溶液☁✘₪。待瓊脂糖溶液冷卻至 60℃右時│•☁，加入溴化乙錠( EB )至終濃度為 0.5μg/mL│•☁， 充分混勻後│•☁，輕輕倒入已放置好梳子的模具中│•☁，凝膠長度要大於 10cm│•☁，厚度宜為 3mm~5mm☁✘₪。檢查梳齒下或梳齒間有無氣泡│•☁，用一次性吸頭小心排掉瓊脂糖凝膠中的氣泡☁✘₪。當瓊脂糖凝膠*凝結硬化後,輕輕拔出梳子│•☁，小心將膠塊和膠床放入電泳槽中│•☁，樣品孔放置在陰☁✘₪。向電泳槽中加入 1×TAE 電泳緩衝液│•☁，液麵高於膠面 1mm~2mm☁✘₪。將5μL PCR 產物與 1μL 6×上樣緩衝液混勻後│•☁，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液麵下膠孔│•☁，小心上樣於孔中；陽性對照的 PCR 反應產物加入到最後一個泳道;第一個泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker ☁✘₪。接通電泳儀電源│•☁，根據公式••╃││： 電壓=電泳槽正負極間的距離（cm）×5V/cm 計算並設定電泳儀電壓數值；啟動電壓開關│•☁，電泳開始以正負極鉑金絲出現氣泡為準☁✘₪。電泳 30min~45min 後│•☁，切斷電源☁✘₪。取出凝膠放入凝膠成像儀中觀察結果│•☁，拍照並記錄資料☁✘₪。

u  可使用 Gold view·✘▩◕╃、Gal-Rad 等等效的核酸熒光染料替代 EB☁✘₪。

u  推薦使用 DNA Marker••╃││：DL2000 或 100bp ladder│•☁，等可指示 100bp~1500bp 條帶的 Marker☁✘₪。

◆    結果分析

1.陰陽性判讀••╃││：

進行電泳檢測時│•☁，需對比 Marker 進行判斷│•☁，當目的靶標對應位置出現單一顯著條帶時可判斷該靶標為陽性； 否則為該靶標檢測為陰性☁✘₪。（使用熒光定量 PCR 儀檢測時│•☁，檢測孔Ct≤30 時判斷該孔為陽性；當檢測孔Ct＞30 時│•☁， 該檢測孔為陰性）

示例電泳圖

2.有效性判讀••╃││：

需同時滿足••╃││：1.空白對照中所有泳道均為陰性；2.陰性對照中 uidA 泳道陽性│•☁，其餘泳道陰性；2.陽性對照中所有泳道陽性│•☁，此時可判斷實驗有效☁✘₪。如無法滿足上述條件│•☁，則實驗無效│•☁，需重複實驗；如重複後結果仍為無效│•☁，請於本公司技術支援聯絡☁✘₪。

3.結果判讀••╃││：

在實驗有效的情況下│•☁，可根據下表進行判讀••╃││：

u  97%以上大腸埃希氏菌為 uidA 陽性│•☁，可參考陰性對照中該基因檢測結果判斷擴增效果；

u  當結果判定為EPEC 陽性時│•☁，若 bfpB 靶標為陽性則說明樣品含有典型EPEC；若 bfpB 靶標為陰性則說明樣品為非典型EPEC；

當結果判定為STEC/EHEC 陽性時│•☁，若 eae 靶標為陽性則說明樣品含有典型EHEC；若 eae 靶標為陰性則說明樣品為非典型EHEC☁✘₪。